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食品安全国家标准-食品微生物学检验-大肠菌群计数

GB 4789.3-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数

录入时间:2010-4-28 9:02:54 来源:国家卫生部

前言
本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数》。
本标准与GB/T 4789.3-2008相比,主要修改如下:
——修改了标准的中英文名称;
——"第二法 大肠菌群平板计数法"的平板菌落数的选择范围修改为"15 CFU~150 CFU";
——删除了"第三法 大肠菌群Petrifilm TM测试片法"。
本标准的附录A、附录B为规范性附录。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为:
——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。

食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
1 范围
本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2 术语和定义
2.1 大肠菌群 coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数 most probable number,MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3.1 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。
3.3 恒温水浴箱:46 ℃±1 ℃。
3.4 天平:感量 0.1 g。
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶:容量 500 mL。
3.9 无菌培养皿:直径 90 mm。
3.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
3.11 菌落计数器。
4 培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose,LST)肉汤:见附录 A 中 A.1。
4.2 煌绿乳糖胆盐(Brilliant Green Lactose Bile,BGLB)肉汤:见附录 A 中 A.2。
4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(Violet Red Bile Agar,VRBA):见附录 A 中 A.3。
4.4 磷酸盐缓冲液:见附录 A 中 A.4。
4.5 无菌生理盐水:见附录 A 中 A.5。
4.6 无菌 1 mol/L NaOH:见附录 A 中 A.6。
4.7 无菌 1 mol/L HCl:见附录 A 中 A.7。

 

第一法 大肠菌群 MPN 计数法
5 检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
大肠菌群MPN计数的检验程序

 

图1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序

6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品:称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋 中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min,制成 1:10 的样品匀液。
6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成 1:10 的样品匀液。
6.1.3 样品匀液的 pH 值应在 6.5~7.5 之间,必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。
6.1.4 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌 吸管反复吹打,使其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。
6.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次,换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过 15 min。
6.2 初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1 mL,则用双料LST肉汤),36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察倒管内是否有气泡产生,24 h±2 h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续 培养至48 h±2 h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
6.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。
6.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告
按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的 MPN值。

第二法 大肠菌群平板计数法
7 检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。
大肠菌群平板计数法的检验程序

 

图2 大肠菌群平板计数法检验程序
8 操作步骤
8.1 样品的稀释
按6.1进行。
8.2 平板计数
8.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
8.2.2 及时将15 mL~20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板,置于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。
8.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在 15 CFU~150 CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为 0.5 mm 或更大。
8.4 证实试验
从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于 BGLB 肉汤管内,36 ℃±1 ℃ 培养 24 h~48 h,观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。
8.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g (mL)样品中大肠菌群数。例:10-4 样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取 其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105 CFU/g(mL)。

食品微生物学检验2010标准
食品微生物学检验2010标准(GB 4789)已于2010年3月正式颁布并于2010-06-01开始实施.
详细请看:
GB 4789-2010检验标准
GB 4789-2010培养基目录
食品微生物学检验2010标准
GB 4789.1-2010 总则
GB 4789.2-2010 菌落总数测定
GB 4789.3-2010 大肠菌群计数
GB 4789.4-2010 沙门氏菌检验
GB 4789.10-2010 金黄色葡萄球菌检验
GB 4789.15-2010 霉菌和酵母计数
GB 4789.18-2010 乳与乳制品检验
GB 4789.30-2010 单核细胞增生李斯特氏菌检验
GB 4789.35-2010 乳酸菌检验
GB 4789.40-2010 阪崎肠杆菌检验
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